标签卵白(Protein Tag)和标签卵白抗体
标签卵白(Protein Tag)和标签卵白抗体
标签卵白是与目标卵白一同交融表达的一种多肽大概卵白，以便于目标卵白的表达、检测、示踪和纯化等。
主要分为两类，一类为将目标卵白质分散纯化(留存下去)的亲和吸附标签。
卵白纯化→His标签；
Western bloting（卵白质印迹法）→Flag标签；
免疫共沉淀→Flag、HA或cMyc标签；
另一类为盲目荧光标签，它们主要使用于目标卵白表达代谢的动态监测，较为常用的为荧光素酶报告基因体系（上期已先容）和荧光卵白家属。
标签卵白抗体是一类颠末亲和纯化的小鼠单克隆抗体。用于检测种种商品化表达载体上的标签序列（如：MyC、His、GST、HA等），籍以分析检测目标卵白的表达含量及其功效。
其原理是抗原—抗体反响，这些标签抗体可以高度特异地团结对应的标签交融卵白。标签抗体是展开基因卵白表达、信号转导和基因功效研讨的常用东西。
一、亲和吸附标签
亲和标签是重组卵白纯化的一个紧张且好效的东西，它们不仅便于对交融卵白举行检测与纯化，并且约莫对目标卵白的理化实质产生有利的影响，包含提高重组卵白的产量、加强重组卵白的可溶性以及促进重组卵白的准确折叠等。较为常用的几种标签为6*His(6个组氨酸)、Flag、HA、c-Myc和GST标签。
20种氨基酸称呼和英文缩写：
丙氨酸（Ala-A）、缬氨酸（Val-V）、亮氨酸（Leu-L）、异亮氨酸（ile-I）、
脯氨酸（Pro-P）、甘氨酸（Gly-G）、蛋(甲硫)氨酸（Met-M）、色氨酸（Trp-W）、
苯丙氨酸（Phe-F）、谷氨酰胺（Gln-Q）、丝氨酸（Ser-S）、苏氨酸（Thr-T）、
半胱氨酸（Cys-C）、天冬酰胺（Asn-N）、酪氨酸（Tyr-Y）、天冬氨酸（Asp-D）、
谷氨酸（Glu-E）、赖氨酸（Lys-K）、精氨酸（Arg-A）、组氨酸（His-H）
① 依据实行目标选择切合的标签；
② 确定标签卵白对目标卵白的表达对否产生干扰；
③ 确定标签卵白标志的地点是在目标卵白的N端照旧C端。
6*His：
6*His是指六个组氨酸残基构成的交融标签，可插进在目标卵白的C末了或N末了。其作为标签，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成共同的布局特性（团结配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有剧烈的吸引力，可用于安稳化金属螯合层析(IMAC)，对重组卵白举行分散纯化。
使用His-tag有底下特点：
1.标签的分子量小，仅有~0.84KD，寻常不影响目标卵白的功效；
2.His标签交融卵白可以在非离子型外表活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的卵白取得使用，后者在纯化包容体卵白时特别有效，用高浓度的变性剂溶解后经过金属螯和亲和层析去除杂卵白，使复性不受别的卵白的干扰，或举行金属螯和亲和层析复性；
3.His标签交融卵白也被用于卵白质-卵白质、卵白质-DNA互相作用研讨；
4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的卵白直接注射生物举行免疫制备抗体；
5.可使用于多种表达体系，纯化的条件平和；
6.可以和别的的亲和标签一同构建双亲和标签。
Flag
Flag标签卵白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），是第一个为用于交融卵白而计划的表位标签，并且是唯逐一个哀求专利的标签。标签中多个带负电的氨基酸不太约莫影响靶卵白活性。带有FLAG标签的卵白可以用特定的抗体M1、M3、M5来识别或吸收。FLAG不休被用于细菌、酵母和哺乳生物细胞中。3X FLAG可以改良FLAG标签的检测。
FLAG作为标签卵白，其交融表达目标卵白后具有以下特点：
1.FLAG作为交融表达标签，其通常不会与目标卵白互相作用并且通常不会影响目标卵白的功效、实质，如此就有使用研讨职员对交融卵白举行卑劣研讨；
2.交融FLAG的目标卵白，可以直接经过FLAG举行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的交融卵白，并且纯化听从高；
3.FLAG作为标签卵白，其可以被抗FLAG的抗体识别，如此就便利经过WesternBlot等办法对含有FLAG的交融卵白举行检测、判定；
4.交融在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而取得特异的目标卵白。因此现FLAG标签已广泛的使用于卵白表达、纯化、判定、功效研讨及其卵白互相作用等干系范畴。
HA
HA标签卵白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素外表抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶卵白的空间布局影响小,容易构建成标签卵白交融到N端大概C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。
c-Myc
C-Myc标签卵白，Myc标签包含了人类原癌基因Myc中拥有10个氨基酸的片断（EQKLISEEDL）这10个氨基酸作为抗原表位表达在不同的卵白质框架中仍可识别其相应抗体。由于有高特异性的抗Myc单克隆抗体，它被广泛用于检测体系。它很少用于纯化。Myc标签不休被用于卵白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实行。
V5
V5表位标签，GKPIPNPLLGLDST，来自于副黏液病毒P/V卵白。副黏液病毒，一种反义RNA病毒，会招致一些稀有的人类疾病，诸如腮腺炎，麻疹，支气管炎，肺炎和哮吼。哺乳生物和昆虫表达体系通常会用到V5标签。固然它也用于卵白质纯化，该标签关于卵白质检测屡屡是很有效的，诸如在卵白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实行中。
Avi Tag
AviTag标签卵白是一个15个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标卵白的N端和C端。交融表达后，可被生物素毗连酶生物素化，为了纯化重组卵白选用低亲和性的单体抗生物素卵白或抗生物素卵白衍生物，除了用于卵白质分散纯化，还用于卵白质互相作用研讨。
Avi Tag标签体系具有以下几大特点:
1.无论在体外大概体内，几乎一切的卵白都可以在一个共同的AviTag位点容易且好效地被生物素化；
2.生物素化是经过酶和底物的反响来完成，反响条件相当平和并且标志的专注性极高；
3.生物素AviTag仅有15个氨基酸，对卵白空间布局的影响十分小。
GST
GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签卵白本身是一个在解毒历程中起到紧张作用的转移酶，它的天然轻重为26KD。主要使用在原核表达中，将其使用在原核表达的缘故大抵有两个，一个是由于它是一个高度可溶的卵白，渴望可以使用它增长外源卵白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中多量表达，起到提高表达量的作用。
GST交融表达体系广泛使用于种种交融卵白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。团结的交融卵白在非变性条件下用10mM复原型谷胱甘肽洗脱。在大大多情况下，交融卵白在水溶液中是可溶的，并构成二体。
GST标签可用酶学分析或免疫分析很便利的检测。标签有助于保护重组卵白免受胞外卵白酶的降解并提高其安定性。在大大多情况下GST交融卵白是完全或局部可溶的。
纯化：该表达体系表达的GST标签卵白可直接从细菌裂解液中使用含有复原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂举行纯化。GST标签卵白可在平和、非变性条件下洗脱，因此保存了卵白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会丢失对谷胱甘肽树脂的团结才能，因此不克不及在纯化缓冲液中参加强变性剂如：盐酸胍或尿素等。
假如要去除GST交融局部，可用位点特异性卵白酶切除。
检测：可用GST抗体或表达的目标卵白特异性抗体检测。
SUMO
SUMO标签卵白是一种小分子泛素样修饰卵白（
Smallubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家属的紧张成员之一。在一级布局上，SUMO与泛素仅有18%的同源性，但是两者的三级布局及其生物学功效却十分相似。研讨发觉SUMO可以作为重组卵白表达的交融标签和分子伙伴，不仅可以进一步提高交融卵白的表达量，且具有抗卵白酶水解以及促进靶卵白准确折叠，提高重组卵白可溶性等功效。
别的SUMO另有一项紧张的使用，就是可用于完备地切除标签卵白，取得天然卵白。由于SUMO卵白水解酶能识别完备的SUMO标签卵白序列，并能高效地把SUMO从交融卵白上切割下去。切除SUMO后，颠末亲和层析，去除标签卵白局部，就取得和天然卵白一样的重组卵白。以是SUMO标签也常用于和其他标签一同使用，作为特异酶切水解位点。
Halo Tag
Halo Tag标签卵白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种构成的Halo Tag配基好效地共价团结。这个分子量为33KDa的单体卵白能交融在重组卵白的N端或C端，并在原核和真核体系中表达。
HaloTag配基是小分子化学物，可以在体外或体内与Halo Tag卵白共价团结。这些配基由两个紧张组分构成：(1)一个是通用的Halo Tag反响联合子，团结Halo Tag卵白；(2)一个是功效基团,比如荧光染料或亲和前言。
可以共价和特异性团结多种构成的报告基团和亲和配基的特性，使得Halo Tag卵白可以用于检测和亲和团结或固相化安稳目标卵白。
SNAP-Tag
SNAP-Tag是新一代的卵白标签武艺，不仅专注性极高并且安定，最大的优点是实用于多种情况下的卵白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGEgels)等。
SNAP-Tag是从人烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶取得。无论体内照旧体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价团结，使卵白标志上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。
SNAP所带的活性巯基位点承受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，开释出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价团结使SNAP所带的目标卵白携带上了苯甲基基团所带的标志物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下安定，并且没有其他卵白会和这类物质作用，以是SNAP标签反响是高特异的。
检测：生物素或种种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可浸透进入细胞，便利快捷地举行活细胞内SNAP-Tag交融卵白的标志与检测。它们也可特异性地标志大肠杆菌，酵母和哺乳生物等细胞抽体液或以前纯化的卵白液中的SNAP-tag交融卵白。
将纯化的或未纯化的SNAP-Tag交融卵白与外表安稳了苯甲基鸟嘌呤的基质殽杂，卵白即可特异与底物作用，构成共价键，交融卵白直接被安稳在了基质外表上，可以到达更便利快捷地研讨卵白功效或纯化卵白的目标。
MBP
MBP（麦芽糖团结卵白）标签卵白轻重为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增长在细菌中过量表达的交融卵白的溶解性，尤其是真核卵白。MBP标签可经过免疫分析很便利地检测。有必要用位点专注的卵白酶切割标签。假如卵白在细菌中表达，MBP可以交融在卵白的N端或C端。
纯化：交融卵白可经过交联淀粉亲和层进一步纯化。团结的交融卵白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中举行洗脱。团结亲和力在微摩尔范围。一些交融卵白在0.2%Triton X-100或0.25%Tween 20存本人不克不及好效团结，而其他交融卵白则不受影响。缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不克不及使用变性剂。假如要去除MBP交融局部，可用位点特异性卵白酶切除。
检测：可用MBP抗体或表达的目标卵白特异性抗体检测。
二、荧光卵白
荧光蛋白发光团无物种专注性，且不依托任何介质发光，以是转入宿主细胞的荧光卵白基因表达很安定，并对大大多宿主细胞无影响，能体现单个或多个基因的表达情况。别的，在细胞转染实行中，载体上带有一个荧光卵白可以很明晰、直观地察看细胞的转染听从。
eGFP/eCFP/eYFP/mCherry
分散是加强型绿色荧光卵白/加强型黄绿色荧光卵白/加强型黄绿色荧光卵白/单体赤色荧光卵白,具有不同的引发波长发射波长为，均由野生型荧光卵白经过氨基酸渐变和暗码子优化而来，更普通的说法应该是报告基因。
就eGFP而言，干系于GFP，其荧光强度更强、荧光实质更安定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的交融卵白在真核表达体系中表达听从更高。mCherry是从DsRed演化来的功能最好的一个单体赤色荧光卵白，可以和GFP系列荧光卵白共用，完成多色标志体内、外实行标明，mCherry在N端和C端交融外源卵白时，荧光卵白活性和被交融的目标卵白功效互相没有分明影响。
这些荧光标签卵白，其交融表达目标卵白后具有以下特点：
1.不必决裂构造细胞和不加任何底物，直接经过荧光显微镜就能在活细胞中发射绿色荧光，及时体现目标基因的表达情况，并且荧光实质安定，被誉为活细胞探针；
2.其盲目荧光，不需用目标基因的抗体或原位杂交武艺就可推知目标基因在细胞中的定位等情况；
3.同时细胞内的别的产物不会干扰标签卵白检测，从而使其检测更显得快速、笨重、敏捷度高并且重现性高；
4.其低斲丧、高敏捷度检测，十分实用于高通量的药物挑选。因此现eGFP表达标签被广泛地使用于基团表达调控、转基因功效研讨、卵白在细胞中的功效定位、迁徙厘革及药物挑选等方面。
5.mCherry赤色荧光卵白在标志病毒颗粒，研讨病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的上风。如用mRFP或mCherry标志HIV病毒颗粒，研讨HIV和宿主细胞间的互相作用以及HIV侵染宿主细胞的历程．用mRFP标志慢病毒颗粒，研讨慢病毒在小鼠体内的复制历程等。
标签抗体，别号为抗原表位，又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的特别地区或基团，是与抗体特异性团结的布局或序列。随着生物武艺的提高，科研职员可以经过DNA重组武艺，构建包含目标基因以及表位标志的交融卵白，进而经过特异性标签抗体对其判定与纯化，以到达研讨的需求。常用的标签包含myc、HA、Flag、His、GST等。
1. Flag标签—抗Flag标签抗体
Flag标签体系是使用一个短的亲水性八氨基酸肽(DYKDDDDK)交融到目标卵白。Flag标签可位于卵白质的C端或N端，该体系已广泛使用于种种细胞典范，包含细菌、酵母和哺乳生物细胞等，相应的Flag标签抗体也被广泛使用。由于Flag标签体系的纯化条件好坏变性的，因此可以纯化一切有活性的交融卵白。Flag标签可以经过到场肠激酶处理去除，肠激酶专注识别该肽序列C末了的5个氨基酸残基。Flag抗体可以用于检测和Flag标签交融表达卵白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测Flag交融表达卵白等。
2.His标签—抗His标签抗体
His标签是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)构成的短肽,专门计划用于重组卵白质的吸附纯化。由于分子量较小，并且较容易分散和纯化，His交融标签与其他标签比拟有很多分明上风，是现在用于纯化的交融标签中使用最为广泛的一种。使用 His标签可以创建一个基于交融卵白的高效检测和纯化体系。His抗体可以用于检测和His标签交融表达卵白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测His交融表达卵白等。
3. GST标签—抗GST标签抗体
GST标签体系具有卵白表达产率高、表达产物纯化便利，以及利于GST抗体制备等特点。GST交融卵白在水溶液中可溶，可从细菌裂解液中提取，在安定性的条件下经过亲和层析取得。GST交融卵白可被位点特异性卵白酶裂解，从而撤除GST卵白。交融卵白又是一个十分好的强免疫原，因此，很容易制备抗新卵白的抗体。正是由于以上的优点，商品化的GST交融卵白表达体系以及GST标签抗体体系至今仍被广泛使用。比年来在原核表达体系中，谷胱甘肽S转移酶GST表达纯化体系的使用更为广泛。
4. Myc标签—抗Myc标签抗体
Myc标签(序列为:EQKLISEEDL)在WB杂交武艺、免疫沉淀IP和流式细胞术中均取得告捷运用，可用于检测重组卵白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。Myc重组卵白质可经过偶联Myc标签抗体到二乙烯砜活化的琼脂糖上而举行亲和纯化。Myc标签可放在C端或N端，但Myc重组卵白的低pH洗脱条件屡屡会低落卵白质的活力，因此Myc标签体系广泛使用于检测但很少用于纯化。
5. HA标签—抗HA标签抗体
HA标签泉源于人类流感血凝素的98-106位氨基酸，使用一个HA (influenza hemagglutinin epitope: YPYDVPDYA)短肽交融到目标卵白。HA标签具很强的免疫反响性，被广泛用于HA交融目标卵白的分散、纯化、检测和示踪。重组的HA标签卵白可以使用偶联有HA高特异性单克隆抗体的树脂来完成高效纯化。HA标签体系HA标签可位于卵白质的C端或N端，该体系已广泛使用于多种细胞典范，相应的HA标签抗体也被广泛使用，HA标签抗体能特异识别C末了或N末了带有HA标签(HA-tagged)的交融卵白。
6. GFP标签—抗GFP标签抗体
绿色萤光卵白(Green Fluorescent Protein)，简称GFP，在蓝色波长范围的光源引发下会发射绿色萤光。GFP或其渐变体EGFP等被广泛用于基因表达听从的检测，以及和目标卵白交融表达用于检测目标卵白的表达和分布。寻常来说，GFP抗体不仅可以检测GFP或其得当的渐变体，也可以检测和GFP或其得当的渐变体交融表达卵白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测GFP交融表达卵白等。
